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Étude moléculaire du développement de l'appareil génital mâle
(ACR)
- Mot(s) clé(s) :
Composé chimique, Facteur du milieu : btg, caf1, miarn
Phénomène, processus et fonction : hypospadias, spermatogénèse
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Composé chimique, Facteur du milieu : btg, caf1, miarn
Phénomène, processus et fonction : hypospadias, spermatogénèse
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- Description détaillée :
Biologie cellulaire
- Culture de cellule
- Elutriation de cellule de Sertoli
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Biologie cellulaire
- Culture de cellule
- Elutriation de cellule de Sertoli
- Etablissement de lignée

Biologie moléculaire
- Isolement de gènes et de séquences régulatrice

Biochimie
- Electrophoresis bi-dimensionnelle et caratérisation de protéine

Epidémiologie
- Analyse statistique et dépouillement des résultats

La régulation du métabolisme des ARNm joue un rôle très important dans le contrôle de l'homéostasie cellulaire (différenciation, cycle cellulaire, apoptose...). Par le modèle original que nous avons créé, nous pouvons aborder la question de l'importance de la déadénylation des ARNm dans les cellules de Sertoli et mettre en évidence de nouvelles voies de signalisation.
L'étude de l'hypospade nous permet d'aborder le rôle important des polluants dans le développement de cette pathologie.
Plusieurs années. - Modèle permettant de mieux comprendre la gamétogenèse stérilité, utilisation de gamète mâle pour la recombination homologue.
- Relation entre environnement et pathologie uro-génital. - Gérard Cabello, Laboratoire de différenciation cellulaire et croissance, INRA Montpellier.
- Jacques Samarut, Bertrand Pain, CNRS-INRA UMR 5161 Lyon.
- Tadashi Yamamoto, Université de Tokyo.L'objectif de ce groupe est de mieux comprendre le développement et la différenciation des gonades mâles et des organes génitaux externes. Pour cela, nous utilisons deux modèles - les souris invalidées pour le gène CAF1 et l'hypospade. Dans le premier cas, nous cherchons à savoir comment le contrôle de la dégradation des ARNm par CAF1 peut interférer dans les processus de différenciation. Dans le second, nous recherchons les causes (génétiques, hormonales, milieu extérieur) provoquant cette anomalie uro-génitale. L'équipe 4 s'intéresse au développement et à la différenciation des gonades mâles et des organes génitaux externes. L'équipe s'est formée, en janvier 2003, du fait de sa complémentarité thématique et technique. Nous collaborions déjà depuis 2 ans ; JP Rouault, CR1 CNRS, et Cyril Berthet ont invalidé le gènes CAF-/- chez la souris et AM Morera, CR1 INSERM, MA Chauvin et MJ Asensio ont décrit le phénotype et recherché les causes de la stérilité des souris CAF-/-. Nous avons choisi de nous implanter dans l'unité 418 car elle présente un environnement scientifique favorable au développement de nos recherches. La différenciation des gonades est abordée par l'étude de différents mécanismes de régulations post-transcriptionnelles impliquées dans la spermatogenèse (miARN et modèle des souris CAF1). Le développement des organes génitaux est étudié dans le modèle pathologique hypospadias.
Le gène CAF1[-associated factor] est une protéine appartenant à un complexe multimérique, le complexe CCR4-NOT. Ce complexe est très conservé au cours de l'évolution et est impliqué dans le métabolisme des ARNm. Il agit en effet du contrôle de la transcription jusqu'à la dégradation des ARNm puisqu'il est également la principale déadénylase de la levure ; CAF1 étant un cofacteur majeur de ce complexe. Nous nous sommes intéressés à cette protéine CAF1 par l'intermédiaire de la famille BTG que nous avions préalablement caractérisée. Ces protéines contrôlent négativement le cycle cellulaire et l'une d'entre elles, BTG2, est régulée transcriptionnellement par P53. En recherchant des partenaires des protéines BTG afin de mettre en évidence leur fonction biochimique, nous avons montré que CAF1 s'associait à ces protéines BTG. Par conséquent, CAF1 semblait intégrer de nombreuses fonctions médiées par les protéines BTG et nous permettait d'imaginer une voie de signalisation allant de P53 à la dégradation des ARNm.
Afin de mieux comprendre l'importance de cette voie et d'établir des modèles d'étude, nous avons invalidé ce gène chez la souris par recombinaison homologue. Les souris CAF1(-/-) ne présentent pas d'anomalie phénotypique majeure si ce n'est une stérilité mâle. Cette stérilité est due à un défaut de jonction entre les cellules de Sertoli (au niveau de la barrière hémato-testiculaire). La spermatogenèse ne peut se dérouler correctement dans ce cas, ce qui provoque la stérilité des souris mâle CAF1(-/-). La protéine CAF1 a donc un rôle primordial dans le développement de l'appareil génital mâle.
Afin de comprendre comment CAF1 intervient dans les cellules de Sertoli, nous avons comparé les profils d'expression protéiques des cellules CAF1 (+/+) et (-/-) par électrophorèse bidimensionnelle. L'identité des protéines surexprimées dans les cellules CAF (-/-) est établie par des techniques de spectroscopie de masse. Nous testons actuellement les protéines candidates afin de déterminer par quels mécanismes CAF1 régule leur expression.
Par ces expériences nous pourrons caractériser les séquences de reconnaissance spécifique du complexe CCR4-NOT sur les ARNm. Plus généralement, comme cette voie est en partie contrôlée par le "gène suppresseur de tumeur P53", cela nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en place par une cellule en réponse à divers agents (stress génotoxique, apoptose, arrêt de cycle) utilisant P53 comme effecteur.
D'autre part, nous nous intéressons au rôle potentiel des mi ARN dans la spermatogenèse. Les miARN ont des petits ARN non codants qui inhibent la traduction ou dégradent leurs ARN messagers cibles. Ils sont impliqués dans de multiples processus cellulaires. Nous avons pu montrer que mir-34C était spécifiquement exprimé dans le testicule. Par ailleurs, il apparaît que sa surexpression dans des cellules ES indifférenciées permet leur engagement vers le stade PCG (apparition de marqueurs tels DAZ2, VASA).
Actuellement, nous procédons à des expériences d'HIS afin de préciser ces territoires d'expression pour chercher aussi à déterminer comment mir-S4C agit dans les cellules ES en procédant à des analyses transcriptomiques (microarray des cellules ES transfectées ou non). Ces expériences nous permettront de mieux comprendre son mode d'action. Par ailleurs, nous envisageons de le surexprimer ou d'invalider son expression dans des testicules de souris pour statuer sur son importance fonctionnelle au cours de la spermatogenèse.

Recherche des causes de l'hypospadias
L'hypospadias est une malformation congénitale de la verge. C'est un défaut de fermeture de la gouttière uréthrale pendant la vie foetale. Ce phénomène dépendant des hormones exige un déroulement spatio-temporel très précis. Cette étape de la différenciation sexuelle est sous le contrôle de la testostérone et de son métabo-lisme local par la 5alpha-réductase en dihydrotestos-térone (DHT) qui exerce son action via les récepteurs des androgènes. Des causes génétiques ont été avancées concernant essentiellement 1) les gènes impliqués dans le développement des gonades mâles et leur capacité à produire de la testostérone et à la transformer en DHT et 2) le gène du récepteur aux androgènes. Mais ces causes sont rarement retrouvées et la grande majorité des enfants ont un bilan endocrinien parfaitement normal à la naissance et une réponse locale aux androgénes satisfaisantes. La fréquence de l'hypospadias est de 1 petit garçon sur 300 et est en constante augmentation. Cette augmentation pourrait être en rapport avec l'usage de plus en plus répandu de "pertubateurs endocriniens" qui interfèrent avec le développement embryologique uro-génital des sujets masculins. Une augmentation de l'incidence des hypospadias a été également observée chez les enfants nés de procréation médicalement assistée. Le but de notre travail est donc d'individualiser les causes majeures et d'établir des familles physiopathologiques. Le traitement, uniquement chirurgical, s'accompagne fréquemment de complications telles que des fistules et des sténoses nécessitant de nombreuses reprises source de graves problèmes psychologiques. La connaissance des causes et des mécanismes est indispensable i) pour la mise en place d'une prévention, ii) pour trouver d'autres modes de traitement ou tout au moins faciliter la chirurgie réparatrice et enfin iii) pour trouver des traitements locaux permettant d'éviter les complications post opératoires
L'étude comprend une enquête épidémiologique qui s'est déroulée en plusieurs étapes : 1) étude comparative des données de la littérature et réalisation de deux questionnaires : un destiné aux parents d'enfants hypospades et un destiné à l'équipe médicale 2) interrogation des parents et étude des dossiers médicaux. 3) création d'un pro logiciel sous Visual Basic pour stocker les données (VBA pour Excel), 4) saisie des données, 5) mise en place d'une analyse statistique automatique (en cours de réalisation).
En plus des facteurs évoqués dans la genèse de l'hypospadias sont apparues d'autres voies de recherche étiologique basés sur les observations des chirurgiens urologues qui évoquent un problème vasculaire sous-jacent. Il n'existe aucun marqueur tardif d'une ischémie pendant la vie foetale. Par contre, les défauts de cicatrisation particulièrement fréquents peuvent être reliés à un défaut persistant de vascularisation encore présent chez le jeune enfant et/ou un déficit en facteurs de croissance. Notre objectif est donc de rechercher et de localiser l'expression de facteurs angiogènes connus comme par exemple le VEGF et ses récepteurs dans les tissus hypospadias et sains et d'étudier leurs régulations par les androgènes et par les facteurs de croissance. Ce travail pourra se réaliser grâce au très grand nombre de patients du service d'urologie pédiatrique, à la création d'une banque tissulaire de tissus pathologiques (déchets opératoires) et de peau normale de circoncision d'une banque cellulaire. Nos premiers résultats sur la vascularisation montrent que le VEGF ne semble pas directement impliqué dans le mécanisme de l'hypospadias. Par contre les récepteurs du VEGF Flt1 et le récepteur soluble pourraient être impliqués. Il n'y a pas de différence pour Flt1 entre les peaux dorsales normales et ventrales hypoplasiques à l'état basal. Par contre la réponse aux androgènes est plus importante dans la peau hypoplasique. La mise en évidence de la protéine Flt1 confirme l'augmentation de Flt1 par les androgènes (DHT) du tissu hypoplasique, suggérant qu'un déficit partiel en production de DHT pendant le premier trimestre de grossesse pourrait avoir un retentissement sur l'expression du récepteur de VEGF ( Flt1) et par conséquent sur l'action du VEGF. Il est également à noter que Flt1 est un récepteur important pour l'action du facteur placentaire angiogène PlGF. Concernant l'expression du récepteur soluble (sFlt1) son expression semble plus importante dans le tissu hypoplasique ce qui aurait pour conséquence de diminuer la bio disponibilité du VEGF. L'examen de ces profils protéiques suggére une dégradation accrue des protéines dans la peau hypoplasique. Nous avons montré en effet un excès de metalloprotéases dont l'analyse est en cours.
Nos projets seront de 1) poursuivre l'étude épidémiologique 2) rechercher des causes génétiques: les causes génétiques bien que rarement démontrées dans les hypospades isolés sont suggérées par le fait qu'un individu apparenté au premier degré est affecté 25 fois plus souvent que ce qui est attendu dans la population générale. Il est également à noter que le risque d'avoir un autre enfant hypospade est plus élevé que le taux généralement associé aux pathologies polygéniques suggérant une hétérogénéité génétique avec l'existence de formes autosomales récessives. L'enquête épidémiologique permettra de trouver des familles informatives pour la recherche de nouveaux gènes. L'étude de ces familles se fera avec leur consentement en collaboration avec des généticiens. 3) rechercher les protéases et leurs cibles au niveau des fistules 4) rechercher des facteurs angiogènes dans les milieux de culture des explants de peau normale et hypoplasique à l'aide du test de tubulisation des cellules HUVEC sur matrigel, 5) analyser en 2D les protéines de la peau normale et hypoplasique, 6) microdissection laser et analyse par PCR multiplex de gènes 7) étude du promoteur de la 5alpha réductase en effet la séquence du promoteur et les régulations de l'expression et de l'activité de cette enzyme clé ne sont pas ou très peu connues. Il serait particulièrement intéressant de connaître l'impact des xénobiotiques sur l'expression et /ou l'activité de la 5alpha réductase. Ce travail pourra se réaliser grâce à la collaboration avec le Pr P. Mouriquand, le Dr P.Y. Mure (service d'urologie pédiatrique), A.F. Valmalle interne (en thèse), le Dr F. Dijoud (service d'anatomopathologie) et L. Chaussegros (étudiante en biostatistique).
L'équipe 4 s'intéresse au développement et à la différenciation des gonades mâles et des organes génitaux externes. L'équipe s'est formée, en janvier 2003, du fait de sa complémentarité thématique et technique. Nous collaborions déjà depuis 2 ans ; JP Rouault, CR1 CNRS, et Cyril Berthet ont invalidé le gènes CAF-/- chez la souris et AM Morera, CR1 INSERM, MA Chauvin et MJ Asensio ont décrit le phénotype et recherché les causes de la stérilité des souris CAF-/-. Nous avons choisi de nous implanter dans l'unité 418 car elle présente un environnement scientifique favorable au développement de nos recherches. La différenciation des gonades est abordée par l'étude de différents mécanismes de régulations post-transcriptionnelles impliquées dans la spermatogenèse (miARN et modèle des souris CAF1). Le développement des organes génitaux est étudié dans le modèle pathologique hypospadias. Réduire

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