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Biologie et écologie des phytoplasmes
(ACR)
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Objet d'étude : bactérie, bactéries, cicadelle, parasite strict, pathogène, phloème
Dispositif technique et méthode d'étude : phylogénie, prophylaxie
Composé chimique, Facteur du milieu : éliciteur, spécificité
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Objet d'étude : bactérie, bactéries, cicadelle, parasite strict, pathogène, phloème
Dispositif technique et méthode d'étude : phylogénie, prophylaxie
Composé chimique, Facteur du milieu : éliciteur, spécificité
Phénomène, processus et fonction : comportement variétal, cycle biologique, évolution, tolérance, vection
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- Description détaillée :
L'objet de recherche fait intervenir les trois partenaires bactérie, insecte et plante et Afficher la suite
L'objet de recherche fait intervenir les trois partenaires bactérie, insecte et plante et s'adresse en particulier aux relations des phytoplasmes ou BLO avec l'un et l'autre de leurs hôtes insecte et plante.
2.1 Biologie et génomique des phytoplasmes et BLO.
Les phytoplasmes n'étant pas cultivables, nous avons établi une collection d'isolats génétiquement très proches au sein de chacun des deux groupes ribosomiques 16SrV (comprenant la FD) et 16SrXII (comprenant le stolbur, le Bois noir, le Dépérissement de la lavande, le SBR). Nous avons montré que les isolats de phytoplasmes transmissibles par la cicadelle vectrice de la FD partagent des caractères moléculaires spécifiques.
Nous poursuivrons le développement et la mise en oeuvre d'outils de détection et d'identification performants moléculaires et sérologiques nécessaires pour la détection in situ, l'épidémiologie moléculaire et pour l'étude phylogénétique des agents pathogènes. L'ADN chromosomique du phytoplasme de la FD sera isolé par électrophorèse en champ pulsé et une carte physique sera établie. Des banques d'ADNc de plantes et d'insectes sains et malades, seront obtenues par HSS afin d'identifier les fonctions bactériennes de la colonisation et du parasitisme.
Collaboration : Biologie Cellulaire et Moléculaire, INRA Bordeaux, Directeur M. Garnier.
2-2 Interactions phytoplasme / insecte vecteur et BLO / insecte vecteur
Au sein du groupe ribosomique 16SrV, nous avons identifié 10 isolats de phytoplasmes : 4 isolats géographiques de FD, transmis au vignoble par Scaphoideus titanus et en insectarium par ce même vecteur élevé ainsi que par le vecteur expérimental, Euscelidius variegatus, 3 isolats de phytoplasmes apparentés viticoles non transmis par S. titanus, et 6 isolats apparentés non viticoles. Une référence extérieure sera la Phyllodie du trèfle (groupe 16SrIB), transmise expérimentalement par les deux espèces de cicadelles citées. Nous maîtrisons l'acquisition, nous connaissons le calendrier des étapes de la circulation du phytoplasme dans le corps de l'insecte et du franchissement des barrières cellulaires, événements clés de la vection au niveau cellulaire.
Au sein du groupe ribosomique 16SrXII (stolbur) nous disposons de 6 isolats. Les vecteurs cixiides devront au préalable être établis en élevages permanents.
Les différentes combinaisons isolat / cicadelle vectrice seront comparées afin d'identifier des marqueurs protéiques communs des systèmes de reconnaissance phytoplasme / barrière cellulaire. Ils seront sélectionnés par western-blot et par far-western blot en 1D et 2D.
Collaboration : UR Interactions Virus Vecteur, INRA de Colmar, Directeur E. Herrbach
Dans le cas du SBR où la transmission du BLO par le cixiide Pentastiridius beieri peut être verticale (Gatineau et al., Phytopathology, 2002), sa localisation dans les organes de l'insecte vecteur et son rôle biologique éventuel seront étudiés par la microscopie et le marquage in situ. Le système biologique sera comparé à celui du BLO de la Chlorose marginale du fraisier transmis par un autre cixiide, Cixius wagnerii.
Collaboration : Biologie cellulaire et moléculaire, INRA Bordeaux, Directeur M. Garnier.
2-3 Interactions phytoplasme / plante et BLO / plante
Colonisation de plantes modèles
Nous avons entièrement modélisé le développement d'une phytoplasmose sur la fève Vicia faba qui peut être inoculée efficacement par un seul spécimen de cicadelle vectrice.
Le phytoplasme du stolbur et le BLO du SBR sont transmis expérimentalement à des betteraves et des pervenches de Madagascar (C. roseus) par des insectes P. beieri capturés ou nés en captivité.
Les processus cellulaires qui président au développement des symptômes primaires et secondaires de la maladie après l'infection par une bactérie du phloème (phytoplasme ou BLO), seront étudiés sur des plantes modèles (fève, pervenche de Madagascar) par la microscopie électronique associée au marquage in situ et à la cytochimie.
Comportement variétal
Des vignes résistantes ou rétablies au coeur de l'épidémie de Flavescence dorée ont été établies en collection.
Plusieurs variétés de vignes porte-greffe (Hybrides de Vitis américains) sont tolérantes (porteur sain) vis-à-vis des phytoplasmes.
Assemblage V. vinifera / porte-greffe : une parcelle a été installée, contenant 33 variétés de V. vinifera assemblées chacune avec 2 porte-greffes différents (5 plants par porte-greffe).
Nous étudierons en modèle et en situation agronomique (insect-proof) le comportement vis-à-vis de nouvelles infections de ceps "rétablis" et leur capacité à transmettre des caractères de "résistance" par voie végétative, ainsi que le comportement des assemblages V. vinifera sensibles / porte-greffe tolérants.
L'effet de molécules respectueuses de l'environnement et pouvant susciter chez les plantes des réactions de défense contre les bactéries vasculaires sera étudié en collaboration avec l'opération 2.
2-4- Protection des cultures contre les phytoplasmes
Nous poursuivrons nos travaux de terrain visant à élucider la biologie et l'éthologie des insectes vecteurs et les conditions dont dépendent le développement des épidémies : refuges, réservoirs, pratiques culturales, facteurs climatiques et écologiques. La lutte biologique contre la cicadelle de la FD sera développée.
Collaboration : UMR Réponse des organismes aux stress environnementaux, INRA Antibes, JC Malausa.
Titre : Biodiversité du phytoplasme de la Flavescence dorée ; Méthodes d'analyse, implications épidémiologiques.

Rappel du contexte :
La Flavescence dorée (FD) de la vigne est une maladie épidémique, présente actuellement dans le sud et sud-ouest de la France et dans le nord de l'Italie. Son agent causal, le phytoplasme FD est un organisme de quarantaine pour la CE, transmis au sein du vignoble par une cicadelle ampélophage, Scaphoideus titanus, qui s'est installée dans une large région climatique. Le génome des phytoplasmes, bactéries parasites stricts, est très mal connu, en particulier les gènes gouvernant la spécificité de transmission par leur cicadelle vectrice.
Le travail s'inscrit dans l'étude de déterminants génétiques des principaux caractères biologiques de la FD, sur la base de comparaison d'isolats de phytoplasmes apparentés infectant ou non la vigne et transmis ou non par la cicadelle de la FD. Une publication antérieure avait utilisé l'analyse multi-RFLP (huit enzymes de restriction) de deux fragments de l'ADN phytoplasmique après amplification dans divers isolats. L'intérêt d'un fragment de l'ADN non ribosomique et d'un système d'amplification gigogne pour son amplification sensible dans des échantillons de vigne à faible titre en phytoplasme avait été montré. Les isolats de FD étaient significativement groupés dans un dendrogramme, mais très proches d'un isolat non viticole, laissant envisager que l'introduction accidentelle d'un tel phytoplasme dans la vigne pourrait initier un cycle épidémique.

Résultats originaux obtenus :
Les mêmes fragments du génome des phytoplasmes FD et apparentés, ont été comparés par l'analyse de la mobilité électrophorétique des hétéroduplex (HMA) d'une part et par l'alignement de leurs séquences nucléotidiques d'autre part.
L'étude montre que la méthode HMA appliquée à des fragments d'ADN correctement choisis, permet d'obtenir des dendrogrammes de parenté plus proches de l'arbre phylogénétique produit par les alignements de séquence que des arbres obtenus par RFLP. Elle permettra la recherche de nouveaux isolats sans recourir au séquençage systématique.
L'étude confirme l'existence de phytoplasmes non viticoles très proches des phytoplasmes FD sensu stricto, qui pourraient être à l'origine de nouveaux foyers de maladie. Toutefois, elle confirme aussi la totale similitude, pour les régions génomiques observées, entre deux isolats majoritaires et présents sur tout le vignoble malade en France et en Italie.

Conséquences, perspectives :
Les systèmes biologiques analysés permettent d'identifier les matériels à choisir pour l'étude des interactions protéines - protéine qui permettent la pénétration du phytoplasme dans les organes de la cicadelle vectrice, sièges de la multiplication et clés de la transmission.
Ces mêmes matériels sont utilisés pour des approches en cours de génomique (PFGE et SSH).
En ce qui concerne l'historique de l'épidémie, il peut être confirmé que le mode principal de la diffusion de la FD dans les années 80 et 90 a bien été la plantation de matériel de multiplication de la vigne contaminé (porteur sain) dans des vignobles où la cicadelle vectrice est préalablement installée. Le choix des mesures de prophylaxie décidées par le SDQPV est guidé par ces acquis.

Collaborations : Istituto sperimentale per la viticoltura, Conegliano-Treviso, Italie.

Publications majeures :
- Angelini E., Negrisolo E., Clair D., Borgo M., Boudon-Padieu E. 2003. Phylogenetic relationships among Flavescence dorée isolates and related phytoplasmas determined by Heteroduplex Mobility Assay and sequences of ribosomal and non-ribosomal DNA. Plant Pathology, 52, 663-672.

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Titre : Détection des phytoplasmes des jaunisses de la vigne en Europe et application à la surveillance des vignobles pour la Flavescence dorée.

Rappel du contexte :
La Flavescence dorée (FD) est une maladie grave de la vigne, causée par un phytoplasme, organisme dont la circulation est interdite en France et organisme de quarantaine pour la CE (voir FD, fiche précédente). Elle est transmise par la cicadelle ampélophage Scaphoideus titanus. Le Bois noir (BN) est une deuxième jaunisse de la vigne (JV) dont l'effet sur le cep est comparable mais non épidémique du fait que sa cicadelle vectrice ne pique la vigne que de façon occasionnelle.
La lutte obligatoire contre la FD (arrêtés ministériels et préfectoraux) ainsi que la commercialisation du matériel de multiplication, exigent que l'on puisse rapidement réaliser le diagnostic d'identification du phytoplasme présent dans les ceps et plants suspects. Les deux phytoplasmes FD et BN appartiennent à des groupes ribosomiques différents. Leur caractérisation fait donc appel à deux tests de diagnostic différents, qui devaient être réalisés l'un et l'autre sur le même échantillon. Or le diagnostic par test PCR exige en outre un protocole "gigogne" car le titre des tissus de vigne en phytoplasme est très faible.

Résultats originaux obtenus :
Deux fragments d'ADN spécifiques respectivement des phytoplasmes apparentés à la FD et au BN ont été identifiés. Deux paires d'amorces disposées en gigogne ont été définies pour chaque fragment et les conditions de PCR ont été adaptées pour réaliser une réaction multiplex dans chaque étape de l'amplification gigogne. Les fragments amplifiés pour le groupe FD et le groupe BN ont des tailles différentes et peuvent donc être identifiés par simple électrophorèse en agarose.
La méthode a été transférée au Laboratoire National de la Protection des Végétaux à Colmar et utilisée en 2002 sur 2000 échantillons suspects de JV en provenance de tous les vignobles de France. Elle a permis de grouper les prélèvements de tissus de vigne par 5 ceps donneurs et de discerner la présence simultanée des deux phytoplasmes dans ces échantillons groupés.
La méthode très sensible et rapide a permis le diagnostic de phytoplasmes dans les racines de plants de pépinière contaminés n'ayant pas montré de symptômes en pépinière.

Conséquences, perspectives :
La méthode réduit le délai de réponse et le coût de mise en oeuvre. Permettant le groupage d'échantillons, elle réduit significativement le nombre de tests à réaliser dans les campagnes de détection, ce qui diminue à nouveau les coûts.
Nous nous acheminons vers sa mise en oeuvre dans le schéma de certification du matériel viticole.

Collaborations : Laboratoire National de la Protection des Végétaux , Colmar

Publications majeures :
- Clair D., Larrue J., Aubert G., Gillet J., Cloquemin G., Boudon-Padieu E., 2003. A multiplex nested-PCR assay for sensitive and simultaneous detection and direct identification of phytoplasma in the Elm yellows group and Stolbur group and its use in survey of grapevine yellows in France. Vitis, 42(3), 151-157.

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Titre : Étiologie et Biologie de la vection du Syndrome des basses richesses de la betterave sucrière (SBR)- Cycle biologique de l'insecte vecteur dans le système cultural betteravier.

Rappel du contexte :
Le Syndrome des basses richesses (SBR) est une nouvelle maladie de la betterave sucrière. Pouvant occasionner une chute de 25 % de la teneur en sucre du pivot atteint, son incidence économique est dépend du degré d'attaque de la parcelle. Un phytoplasme (groupe du stolbur) ou / et une bactérie du phloème (g-3 protéobactérie) provoquent les symptômes et sont tous deux transmis par le même insecte vecteur, le cixiide (Hémiptère, Fulgoromorphe) Pentastiridius beieri. Phytoplasme et BLO sont deux agents bactériens habitant le phloème et non cultivables. Après avoir déchiffré cette étiologie double, l'étude a élucidé le cycle biologique de l'insecte vecteur et la dynamique des deux patho systèmes.

Résultats originaux obtenus :
Le vecteur P. beieri pond ses oeufs sur le collet des betteraves. Les larves (5 stades larvaires) vivent sur les racines et hivernent dans le sol après l'arrachage des betteraves. Les jeunes adultes se nourrissent au début du printemps sur les tiges de la céréale semée dans la parcelle (rotation triennale). Lors du mûrissement des blés et de la recherche de partenaires sexuels, les adultes migrent à la recherche de feuillage succulent et s'installent dans une parcelle de betterave contiguë. L'espèce se maintient donc dans l'environnement proche.
Le phytoplasme du stolbur est acquis de façon irrégulière sur des adventices porteurs (réservoirs). Il n'y a aucune acquisition identifiée par des jeunes insectes (larves) sur des racines contaminées lors de l'été immédiatement précédent. Le système {phytoplasme / cixiide / betterave} est aléatoire et instable. La betterave n'est qu'un prolongement en cul de sac de la niche écologique du phytoplasme.
Le BLO est transmis à la descendance à travers l'oeuf par les femelles porteuses. Il se maintient ainsi à un taux élevé. Le système {BLO / cixiide / betterave} est stable et dynamique.
Le BLO est très proche (98 % d'homologie de l'ADNr 16S) de bactéries endosymbiotiques d'insectes.

Conséquences, perspectives :
La connaissance du cycle du vecteur et de celui du BLO fournissent des axes de recherche de méthodes de lutte, qui pourront s'appuyer sur la recherche d'ennemis naturels.
Les interactions entre le BLO et le cixiide seront étudiées en comparaison avec celles de bactéries endosymbiotiques. Un test spécifique de détection dans l'insecte devra utiliser des séquences sans ambiguïté entre ces deux types d'organismes bactériens.
Les parentés entre le BLO du SBR et le BLO Candidatus Phlomobacter fragariae, agent de la chlorose marginale du fraisier seront étudiées en terme de pouvoir pathogène et de spécificité de vection.

Collaborations : collaboration prévue dans les actions transversales du département avec l'UMR GDPP (IBVM.)

Publications majeures :
- Gatineau F., Jacob N., Vautrin S., Larrue J., Lherminier J., Richard-Molard M., Boudon-Padieu E., 2002. Association of a phytoplasma and a bacterium-like organism both transmitted by a Pentastiridius species with Syndrome des basses richesses of sugar beet. Phytopathology, 92(4), 384-392. Les phytoplasmes sont des bactéries parasites stricts agents de maladies incurables des plantes et transmis spécifiquement par des insectes vecteurs, causant des dommages agronomiques, économiques, mais aussi environnementaux du fait des seules méthodes de lutte disponibles. Comme ils sont limités au phloème, non cultivables, et transmis par des insectes (cicadelles), leur étude et celles des maladies qu'ils provoquent, font appel à des méthodologies élaborées et spécifiques. L'étude de maladies comparables par les symptômes, causées par d'autres bactéries du phloème (Bacterium-like-organisms) et également transmises par des cicadelles, fait appel aux mêmes méthodes expérimentales et d'analyse.
Les maladies étudiées sont : deux jaunisses de la vigne, la Flavescence dorée (FD) et le Bois noir (BN), ayant des vecteurs et une épidémiologie différents; le dépérissement de la lavande et le syndrome des basses richesses de la betterave sucrière (SBR), nouvelles maladies de cultures industrielles, transmises par des cixiides difficiles à éradiquer car leurs larves sont hivernantes et terricoles.
Nos objectifs, dans un contexte de forte demande socio-économique, sont de poursuivre nos recherches sur les interactions des phytoplasmes et BLO avec leurs hôtes (insecte vecteur obligatoire et plante), au niveau moléculaire (reconnaissance cellulaire), cytologique, histologique, variétal et agronomique. En effet, nous avons montré que les phytoplasmes circulent dans le corps de l'insecte et pénètrent dans certaines cellules des glandes salivaires. Par ailleurs, la tolérance des hôtes végétaux apparaît comme une situation d'équilibre limite entre le titre du phytoplasme dans la plante (et donc sa capacité de multiplication) et l'intensité des réactions de défense de la plante. La compréhension de ces mécanismes permettrait sans doute de les induire et donc de réduire l'effet pathogène.
Nous poursuivrons ces travaux au laboratoire ainsi que sur le terrain car l'étude de la vection spécifique par les insectes exige la mise en place de dispositifs de phytopathologie et d'entomologie appliquées en conditions naturelles.
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