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Signalisation cellulaire et moléculaire dans les réactions de défense
(ACR)
- Mot(s) clé(s) :
Objet d'étude : calcium, MAPK, tabac, vigne, vitis vinifera
Composé chimique, Facteur du milieu : adp ribose cyclique, canal ionique, canaux ioniques, éliciteur, gmpc, no, protéine kinase, récepteur, second messager
Phénomène, processus et fonction : modification post-traductionnelle, mort cellulaire, signalisation cellulaire
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Objet d'étude : calcium, MAPK, tabac, vigne, vitis vinifera
Composé chimique, Facteur du milieu : adp ribose cyclique, canal ionique, canaux ioniques, éliciteur, gmpc, no, protéine kinase, récepteur, second messager
Phénomène, processus et fonction : modification post-traductionnelle, mort cellulaire, signalisation cellulaire
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- Description détaillée :
Protection intégrée des cultures.
Formation de jeunes chercheurs et enseignants-chercheurs. Afficher la suite
Protection intégrée des cultures.
Formation de jeunes chercheurs et enseignants-chercheurs. CONTRATS UE AVEC PARTICIPATION

INTERREG (1999-2001)
Titre : " Étude des mécanismes de défense des plantes (modèle pomme de terre surexprimant le pyruvate deshydrogénase) ".
Participant : A. Pugin.
Partenaires : Université de Franche Comté et Université de Berne.
Objectif : La connaissance des mécanismes qui conduisent à la réaction hypersensible et à la résistance systémique acquise est importante car elle peut permettre, à terme, de proposer des solutions pour induire les défenses naturelles de la plante. C'est dans ce contexte que se situe notre projet, sur la base des résultats acquis antérieurement par nos groupes et qui nous ont conduits à nous rencontrer. Dans nos deux modèles indépendants: cellules de tabac traitées par un éliciteur et pomme de terre surexprimant la PDC, des modifications du métabolisme des sucres sont associées ou conduisent à la résistance de la plante. Globalement, notre projet a pour but de comprendre les liens qui existent entre une altération du métabolisme des sucres, le stress oxydatif et l'apparition d'une résistance de la plante au travers des deux modèles complémentaires à notre disposition.2-1 Analyse spatio-temporelle de l'influx de calcium et phosphorylation de protéines
Il est clairement établi que divers signaux impliqués dans le développement chez les animaux et les végétaux induisent des changements déterminants de la concentration en calcium libre dans le cytosol et vraisemblablement dans le noyau et d'autres organites (Lecourieux et al., The Plant Cell, 2002). En particulier, les caractéristiques de l'influx de calcium, l'origine du calcium (extracellulaire ou réservoirs intracellulaires), et son devenir (pouvoir tampon des protéines, accumulation dans la vacuole, le réticulum endoplasmique, les mitochondries par exemple) dictent la spécificité de la réponse biologique. Par ailleurs, le calcium a pour cibles des protéines kinases et des protéines phosphatases situées très en amont de maintes cascades de signalisation. Dans l'action d'éliciteurs de réaction de défense, l'élévation de la concentration en calcium cytosolique libre, l'activation de protéines kinases et l'inhibition de protéines phosphatases sont des évènements très en amont de la cascade.
Grâce aux cellules de tabac exprimant l'aequorine dans le cytosol ou le noyau notre objectif est maintenant de déterminer l'origine du calcium (extracellulaire, pools intracellulaires, lesquels?), son mode de transport (diffusion dans le noyau ou transport?), d'identifier la nature et le mode de régulation des canaux ou transporteurs impliqués (canaux ligand- ,voltage-, ADPRc-, IP3-dépendants?; pharmacologie et patch clamp), les cibles du calcium et en particulier les protéines kinases et phosphatases du cytoplasme et du noyau mais aussi les cibles de ces protéines. Nous appliquerons une approche pharmacologique pour la caractérisation des protéines substrats des kinases et des MAPKs en particulier, l'électrophorèse 2D pour la séparation des protéines phosphorylées in vivo et la spectrométrie de masse pour séquencer les protéines purifiées.
Collaborations : Dr R. Ranjeva, CNRS Toulouse; Prof. S. Delrot, CNRS Poitiers ; H. Sentenac, INRA Montpellier.
2-2 Caractérisation des canaux anioniques activés par la cryptogéine
Nous avons démontré que la cryptogéine active des canaux anioniques perméables au nitrate. L'activation de ces canaux est strictement dépendante d'événements de phosphorylation et d'un influx de calcium. De plus, l'ouverture de ces canaux est nécessaire à l'activation de la NADPH-oxydase, à l'activation de gènes de défense variés, à l'activation d'une kinase de 40 kDa et à l'établissement de la HR (Wendehenne et al. Plant Cell 2002).
Les objectifs fixés actuellement sont d'étudier in vivo la sélectivité anionique de ces canaux vis à vis d'autres anions, de comprendre leur régulation et de les caractériser par patch clamp. Il serait aussi très intéressant de comprendre comment l'activation de ces canaux conduit à l'activation de la NADPH-oxydase.
Ainsi, de par cette étude, notre équipe pourrait participer à la compréhension du rôle de canaux anioniques dans le développement de la plante, sujet d'étude de l'équipe CNRS de Gif/Yvette avec laquelle nous collaborons, ce qui peut permettre de cloner les gènes correspondant dans Arabidopsis avant d'utiliser les mutants pour approfondir l'analyse fonctionnelle.
Collaborations : Drs. H. Barbier- Brygoo et J-M Frachisse, CNRS, Gif sur Yvette; Dr H. Sentenac CNRS/INRA Montpellier.
2-3 Implication de l'oxyde nitrique dans les réponses de défense de la plante
Nous avons montré que la production rapide d'oxyde nitrique (NO), en réponse à la cryptogéine, (Wendehenne et al. 2001) dépend d'événements de phosphorylation et d'un influx de calcium et il a été établi que NO active au moins deux voies: une première conduisant à l'expression de gènes de défense (PAL, CHS, PR-1), une seconde conduisant à la mort cellulaire hypersensible via une potentialisation des effets oxydants des AOS. De plus, NO semble impliqué dans la mobilisation du calcium séquestré dans les compartiments intracellulaires. Nos objectifs actuels sont:
- de déterminer l'origine moléculaire de NO produit en réponse à la cryptogéine,
- de poursuivre notre analyse des liens fonctionnels entre la production de NO et les autres événements déclenchés par l'éliciteur, en particulier, l'activation des MAPKs, des canaux anioniques, des gènes de défense et la HR,
- d'étudier dans notre modèle l'implication possible de seconds messagers classiquement activés chez les mammifères en réponse à NO, en particulier le GMPc et l'ADPRc,
- d'identifier des protéines régulées par NO (protéines nitrosées).
Collaborations : Dr J. Durner, National Research center for Environment and Health, Oberschleissheim, Allemagne, Prof. D. Klessig Boyce Thomson Institut,USA; J.F. Moret-Gaudry, INRA Versailles.
2-4 Mécanismes de défense de la vigne et applications1
Sur la base de nos résultats acquis à l'aide de notre système modèle nos objectifs en cours et futurs sont :
- de décrypter les réactions de défense de la vigne, dont le renforcement des parois cellulaires par le cross link de composés phénoliques, et de préciser le rôle du calcium dans l'activation des défenses,
- d'identifier de nouveaux éliciteurs efficaces chez la vigne,
- de réaliser des essais de protection au vignoble.
Les travaux sur le cross linking des composés phénoliques pariétaux seront réalisés en s'appuyant sur l'expérience acquise chez le tabac où des composés phénoliques de structure comparable à celle des stilbènes de la vigne sont rapidement intégrés dans les parois en réponse à une élicitation (féruloyltyramine et ses dérivés).
Collaborations : Dr Y. Brygoo INRA Versailles; Dr B. Kloareg CNRS/Goemar; Prof. P. Coutos-Thévenot CNRS Poitiers; Dr F. Bailleul Univ. Reims; IUVV Dijon; Dr. A. Michael, Genetics and Microbiology, Institute of Food Research, Norwich, GB; Société Moët et Chandon, Epernay.
1 Cette recherche concernant les réactions de défense de la vigne est fortement soutenue financièrement par des contrats industriels : Société Goémar (St Malo), Société Samabiol (Avignon), et Bureau Interprofessionnel des Vins de Bourgogne (Beaune).
Titre : Signalisation dans les interactions plante-microorganisme

Rappel du contexte :
Dans la plupart de leurs confrontations avec des organismes potentiellement pathogènes les plantes s'opposent à leur développement en activant des mécanismes qui mettent en place des barrières de défenses chimiques et mécaniques efficaces. La compréhension de ces mécanismes et l'identification des acteurs moléculaires impliqués de part et d'autre doivent permettre de trouver les conditions de l'activation des défenses de la plante et permettre ainsi de lutter contre les pathogènes des plantes cultivées autrement que par l'emploi de produits chimiques.

Résultats originaux obtenus :
Nos résultats concernent les mécanismes de défenses des plantes et en particulier :
-l'identification d'éléments de la cascade de transduction impliquée dans l'activation des défenses dans une plante modèle, le tabac et dans une plante d'intérêt agronomique, la vigne,
-le rôle du calcium et des anions, via l'activation de canaux ioniques en réponse à des éliciteurs, dans l'activation des défenses,
-la production de NO, l'activation de MAPK, l'inhibition de transporteurs de la membrane plasmique en réponse à des éliciteurs et la fonction signalisatrice de ces éléments.

Conséquences, perspectives :
Conséquences :
-reconnaissance de l'équipe par le CNRS sous forme d'une UMR,
-obtention d'un GDR CNRS,
-obtention de contrats industriels : Goemar et Samabiol, de 2 bourses de thèse : BIVB, Ministère,
-soutenance de 2 thèses : D. Lecourieux et B. Poinssot en post doc à Vienne (H. Hirt) et Bern (J.P. Metraux) respectivement,
-stages sabbatiques dans l'équipe : Pr. K. Gould (Nouvelle Zélande), C. Van Loon (Hollande),
-obtention d'un poste de Professeur de Biochimie pour 2003.
Perspectives :
-renforcement de l'équipe par le recrutement d'enseignants-chercheurs,
-participation à un projet Human Frontier,
-application au vignoble de la stratégie d'activation des défenses.

Collaborations : R. Ranjeva (CNRS Toulouse), S. Delrot (CNRS Poitiers), R. Douce, J. Joyard, J. Garin (CEA-CNRS Grenoble), H. Barbier-Brygoo (CNRS Gif/yvette), H. Sentenac (CNRS Montpellier),Y. Brygoo (INRA Versailles), D. Klessig (USA), E. Martinoia (Zurich),G. Scherer (Hanovre).

Publications majeures :
- Lebrun-Garcia A, Chiltz A, Gout E, Bligny R, Pugin A 2002. Questionning the role of salicylic acid and cytosol acidification in mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation induced by cryptogein in tobacco cells. Planta 214, 792-797.
- Wendehenne D, Lamotte O, Frachisse JM, Barbier-Brygoo H, Pugin A 2002. Nitrate anion efflux is an essential component of the cryptogein signalling pathway leading to defence responses and hypersensitive cell death in tobacco. The Plant Cell 4, 1937-1951.
- Lecourieux D, Mazars C, Pauly N, Ranjeva R, Pugin A 2002. Analysis and effects of cytosolic free calcium in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells. The Plant Cell 14, 2627-2641.
- Bourque S, Lemoine R, Sequeira-Legrand A, Fayolle L, Delrot S, Pugin A 2002. The elicitor cryptogein blocks glucose transport in tobacco cells. Plant Physiol. 130, 2177-2187.
- Poinssot B, Vandelle E, Bentéjac M, Adrian M, Levis C, Brygoo Y, Garin J, Sicilia F, Coutos-Thévenot P, Pugin A 2003. The endopolygalacturonase I from Botrytis cinerea activates grapevine defence reactions unrelated to its enzymatic activity. Molecular Plant-Microbe Interactions, 6, 553-564.
- Aziz A, Poinssot B, Daire X, Adrian M, Bézier A, Lambert B, Joubert JM, Pugin A 2003. Laminarin elicits defense responses in grapevine and induces protection against Botrytis cinerea and Plasmopara viticola. Molecular Plant-Microbe Interaction, 16(12), 1118-1128.
- Lamotte O, Gould KS, Lecourieux D, Sequeira-Legrand A, Lebrun-Garcia A, Durner J, Pugin A, Wendehenne D 2004. Analysis of nitric oxide funcitons in tobacco cells challenged by the elicitor cryptogein. Plant Physiology, 135, 1-14.
- Wendehenne D, Durner J, Klessig DF 2004. Nitric oxide: a new player in plant signaling and defence responses. Current Opinion in Plant Biology, 7, 449-455.
- in press- Lecourieux D, Lamotte O, Bourque S, Wendehenne D, Mazars C, Ranjeva R, Pugin A 2005. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. De nombreux mécanismes de réception/transduction de signaux sont connus dans le monde animal. Au contraire, dans le monde végétal, nos connaissances dans ce domaine sont encore très fragmentaires. Très peu de récepteurs ont été identifiés et si quelques cascades de transduction sont étudiées, celles en particulier relatives aux signaux hormonaux (acide abscissique, auxine, éthylène, brassinostéroïdes), à la lumière, à des stress biotiques ou abiotiques (salinité, blessure, température), notre connaissance des étapes entre la perception du signal et la réponse physiologique est encore très limitée.
Les interactions plantes/micro-organismes dont le résultat (maladie, symbiose, résistance) est le fruit d'un véritable dialogue moléculaire entre les deux partenaires au cours de l'évolution, sont des modèles d'étude appropriés pour aborder les mécanismes de réception/transduction de signaux chez la plante. Dans le passé, la toxine fongique Fusicoccine s'est avérée un outil fabuleux pour notre compréhension de divers processus physiologiques contrôlés, entre autre, par la H+-ATPase de la membrane plasmique. Plus récemment, l'identification des facteurs Nod des bactéries Rhizobium à l'origine de la fixation de l'azote atmosphérique par les légumineuses et la mise en évidence de leurs effets est considérée comme une découverte majeure en biologie.
L'étude du mode d'action des éliciteurs permet d'obtenir des informations originales sur les voies de signalisation cellulaire chez les végétaux, et la compréhension des mécanismes mis en jeu par la plante pour résister à un agresseur doit déboucher sur des moyens de lutte pouvant être complémentaires ou se substituer à la lutte chimique. Nos objectifs sont de poursuivre notre investigation des voies de transduction des signaux éliciteurs chez le tabac (en liaison avec Arabidopsis) et en particulier d'identifier les protéines et les seconds messagers impliqués spécifiquement pour comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent à la résistance et de transférer notre savoir faire sur une plante d'intérêt économique: la vigne.
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- Champs de rattachement :
 

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