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Génomique et protéomique des interactions plantes/micro-organismes bénéfiques
(ACR)
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Objet d'étude : medicago truncatula, mycorhize à arbuscules, plante cultivée, protéome, transcriptome
Démarche, discipline : Biotechnologie
Dispositif technique et méthode d'étude : biotisation, marqueur moléculaire
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Objet d'étude : medicago truncatula, mycorhize à arbuscules, plante cultivée, protéome, transcriptome
Démarche, discipline : Biotechnologie
Dispositif technique et méthode d'étude : biotisation, marqueur moléculaire
Composé chimique, Facteur du milieu : gène de symbiose, inoculum
Phénomène, processus et fonction : ressource génétique, symbiose racinaire
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- Description détaillée :
1) CONTRATS UE AVEC COORDINATION

INCO-Copernicus (1998-2001)
Titre : " Legume Afficher la suite
1) CONTRATS UE AVEC COORDINATION

INCO-Copernicus (1998-2001)
Titre : " Legume associations with soil microbes : biological solutions for restoring fertility of heavy metal polluted soils in sustainable agroecosystems (PABSHM) " IC15-CT 98-0116.
Participants : V. Gianinazzi-Pearson (Coordinateur), E. Dumas-Gaudot.
Partenaires : ARRIAM, St-Petersburg, RU ; Jagiellonian University, Krakow, PL ; SUAS et Université d'Uppsala, SW; Svalöf Weibull, Svalov, SW ; Université de Bielefeld, DE ; Université d'Ancona, I.
Objectif : Heavy metal (HM) polluted soils can be considered one of the most important problems presently facing sustainable soil management in European countries. Metal-rich mine tailings, smelting, intensive agriculture and sludge dumping, for example, contaminate soils with large quantities of HMs. Growth and mineral nutrition of various agricultural crops are reduced in agroecosystems fragilized by the accumulation of HMs. The general objectives of the project are (1) to restore fertility of HM polluted soils through selection of adapted plant material and exploitation of biotic interactions with beneficial soil microorganisms, and (2) to understand the mechanisms underlying plant tolerance/resistance to HMs and how these affect, or are affected by, symbiotic plant-microbe interactions. Particular attention is given to cadmium, one of the most toxic and frequent soil pollutants in Europe. Pea, an important legume crop in european agriculture, is used as a model plant because of its important genetic diversity and ability to establish symbiotic root associations.Major research activities are focussed on (i) the genetic potential of pea for HM tolerance/resistance, (ii) isolation of HM-tolerant/resistant beneficial root-associated soil microorganisms (PGPR, rhizobia, mycorrhizal fungi), (iii) interactions between HMs, development and efficiency of root-microbe associations and plant tolerance/resistance, (iv) changes in plant gene expression and biochemical pathways related to Cd tolerance/resistance and symbiotic efficiency, (v) structural modifications induced by HMs and sites of sequestration in pea tissues and microsymbionts, (vi) selection of efficient pea-microbe associations for field production.

CRAFT (1999-2001)
Titre : " Elaboration of biological substrate for improving growth and health of micropropagated plants " CT98-FA-S2-9155.
Participants : S. Gianinazzi (Coordinateur), C. Alabouvette.
Partenaires : Univ. Torino, I ; Univ. Liège, B ; MTT, Vihtavuori, FIN ; Biorize SA, Dijon, F ; Battistini, Forli, I ; Agrostar, Wavre, B ; Tahvoset, Pohjankuru, FIN ; Agromillora, Barcelona, SP ; Kekkila, Eurajoki, FIN ; Agri Obtentions, Dijon, F.
Objectif:The aims of this project are :(i) to optimize a peat-based weaning and culture substrate and a fertilization regime suitable for the development of micropropagated peach and strawberry plants,(ii) to select mixes of beneficial micro-organisms to be introduced in such a substrate to help micropropagated plants overcome biotic and abiotic stresses during acclimatization and growth in the nursery,(iii) to define an appropriate test to evaluate the contribution of beneficial microorganisms to plant health and development,(iv) to train nursery staff in the use of beneficial micro-organisms,(v) to validate this new alternative biotechnology under nursery conditions for commercially producing healthy plants.

MYCHINTEC (2000-2003)
Titre : " Mycorrhiza technology for staple food crop production in small-scale sustainable agriculture in China " IC4-1999-30077.
Participants : V. Gianinazzi-Pearson (coordinateur), D. van Tuinen, S. Gianinazzi.
Partenaires : UHOH, Grossbeeren, G ; IIB, Sittingbourne, UK ; Huazhong Agricultural Univ., Wuhan, PRC ; China Agricultural Univ., Beijing, PRC ; Hong Kong Polytechnic Univ., PRC.
Objectif:Arbuscular mycorrhiza technology provides a tool for sustainable plant production by better exploitation of soil resources and in particular phosphate, a shrinking world resource. The project will apply this technology as an innovative tool to enhance productivity of staple food crops in small-scale chinese farming systems, by improving soil fertility and particularly phosphate availability which is low in most agricultural soils in China. A chinese Stock Centre of arbuscular mycorrhizal fungi from north, central and south China will be established, germplasm biodiversity evaluated and an on-line database developed for their registration. Quality-controlled inoculum of isolates with high symbiotic efficiency will be produced on a large scale and directly introduced into traditional production systems of sweet potato, maize and cassava in small chinese farms. Criteria of inoculation efficiency will be persistence of introduced inoculum, monitored using molecular probes obtained within the project, and cost-effective gains in crop yield in the field.

GENOMYCA (2000-2003)
Titre : " Genes and genetic engineering for arbuscular mycorrhiza technology and applications in sustainable agriculture ".
Participants : V. Gianinazzi-Pearson (Coordinateur), D. van Tuinen, S. Gianinazzi.
Partenaires : Univ. Torino, I ; UMR CNRS/U.Paul Sabatier, Castanet, F ; UMR INRA/CNRS, Castanet, F ; MPI, Marbourg, G ; UPO, Alessandria, I ; EEZ, Granada, SP ; SAC, Edinburgh, UK ; Biorize SA, Dijon, F ; Innosense SRL, Colleretto, I ; Cotevisa SA, Valencia, SP
Objectif:Overfertilising, agricultural additives like sewage wastes and atmospheric pollution cause decreases in soil fertility and plant production. Arbuscular mycorrhizal fungi are symbiotic microorganisms central to plant development in natural conditions (biofertilisers, bioprotectors) and can be used as biotools for new strategies in plant production systems. However, their sustainable use in agriculture is still unpredictable and emerging SMEs producing inoculum for plant growers are demanding strains better adapted to this purpose. The objectives of this project are to provide: 1) sound information about genes encoding high value symbiotic functions in arbuscular mycorrhizal fungi, necessary for their optimal exploitation in sustainable agriculture or heavy metal/organically polluted agroecosystems, 2) genetically modified fungal products with new biological properties for plant growth enhancement in polluted soils and with a low impact on the environment, 3) added value arbuscular mycorrhizal fungi for inoculum use in plant production and 4) biosensors for soil pollution.

2) CONTRATS UE AVEC PARTICIPATION

MEDICAGO (2000-2003)
Titre : " Integrated structural, functional and comparative genomics of the model legume Medicago truncatula ".
Participants: V. Gianinazzi-Pearson, D. van Tuinen
Partenaires : INRA/CNRS Toulouse (Coordinateur) ; Université de Bielefeld, G ; MPI, Marbourg, G ; Institut pour l'Innovation-Bielefeld, G ; CNRS-Gif-sur-Yvette, F ; Université de York, UK ; John Innes Centre Norwich, UK ; Académie Hongroise des Sciences-Szeged, H ; Université Wageningen, NL ; Association Européenne de Recherche sur les Protéagineux- Paris, F.
Objectif :The development of sustainable agriculture systems requires improved exploitation of the ability of plants to form endosymbioses with phosphate-scavenging mycorrhizal fungi and nitrogen-fixing nodule bacteria, which play a crucial in nutrient cycilng in most agricultural ecosystems. Medicago truncatula has been chosen as a model legume to study the symbiotic genetic programmes of plants and facilitate the genetics and breeding of important legume crops such as pea, faba bean, alfalfa and clover. The project proposes a functional genetics approach to identify plant genes whose expression is modified in the course of symbiotic and pathogenic interactions, as well as other genes of agricultural importance. Structural genomics will provide genetic and physical maps to establish the distribution of important gens on the genome and facilitate their cloning. Comparative genomics will provide methods tontransfer information gained from M. truncatula to major legume crops.

3) RESEAUX EUROPEENS AVEC COORDINATION

COST 8.38 (1998-2004)
Titre : " Managing Arbuscular Mycorrhizal Fungi for Improving Soil Quality and Plant Health in Agriculture " STSM99/1027 = ERBICC2CT9923247
Président : Silvio Gianinazzi.
Objectif :L'objectif principal de l'Action est d'acquérir de manière compétitive les connaissances théoriques et appliquées, essentielles à l'utilisation des MA pour améliorer la santé et l'adaptabilité des plantes, la production d'aliments de haute qualité et la conservation des ressources naturelles.Ce but sera atteint par :
·la compréhension du rôle des champignons MA,
·la connaissance et l'amélioration de l'équilibre biologique des microorganismes dans la rhizosphère des plantes mycorhizées : la mycorhizosphère,
·l'analyse des bases génétiques, physiologiques, cellulaires et moléculaires du fonctionnement de la symbiose MA,
·la mise en place de technologies pour la production d'inoculum MA,
·le développement d'un règlement de conduite dans l'application de la technologie MA.
Les bénéfices attendus seront une augmentation de l'efficacité dans la production, la réduction des intrants chimiques et une évaluation de la sûreté et des aspects bioéthiques en relation avec l'acceptation par l'opinion publique. Ces bénéfices accéléreront le développement technologique dans un secteur où l'Europe a atteint un rôle prééminent en terme de recherche. L'exploitation des acquis de cette recherche sera mieux réalisée par un dialogue entre scientifiques et utilisateurs et cela sera facilité par l'Action COST proposée.






2-1 Génomique fonctionnelle et programme cellulaire chez les mycorhizes à arbuscules
Grâce aux approches complémentaires d'analyses transcriptomique et protéomique, nous avons déjà mis en évidence l'expression différentielle d'un certain nombre de gènes ou protéines lors de la mycorhization chez le tabac, le pois et la luzerne annuelle (Bestel-Corre et al., Electrophoresis, 2002). Nos objectifs actuels sont de mieux caractériser le génome symbiotique dans sa globalité afin d'identifier les gènes végétaux ou fongiques essentiels au développement et au fonctionnement des MA.
Nous rechercherons les gènes végétaux et fongiques dont l'activité est spécifiquement modulée dans les étapes clés de la mycorhization, dès les premiers contacts cellulaires plante/champignon (formation d'appressoria fongiques) jusqu'à l'établissement d'une symbiose active (présence d'arbuscules intracellulaires). Les transcrits et les protéines (totales, membranaires) associées à ces étapes seront identifiés en ciblant la luzerne annuelle (Medicago truncatula) et ses mutants (non-symbiotique ou hypermycorhizien) en interaction avec les champignons Glomus mosseae ou G. intraradices. Nous utiliserons les approches d'hybridation suppressive soustractive des ADNc, d'exploitation de micro-réseaux d'ESTs, et de cartographie protéique (2DE, spectrométrie de masse). Les comparaisons avec d'autres interactions racine/microorganisme et en différentes situations biologiques nous renseignera sur la spécificité développementale des gènes identifiés.
L'étude protéomique en parallèle de celle transcriptomique à partir d'un même matériel biologique, nous permettra d'identifier les modifications post-traductionnelles qui ne sont pas accessibles par les données génomiques et transcriptomiques. En parallèle, l'étude du protéome symbiotique par analyse de gels in silico sera développée. Les profils électrophorétiques in silico (Pi, PM) de protéines déduites des ESTs dans les banques de données des racines mycorhizées et de champignons MA seront construits et comparés avec les profils peptiques obtenus in vivo, afin de complémenter l'identification des gènes ayant une fonction symbiotique chez M. truncatula et au niveau fongique.
L'étude détaillée des gènes végétaux activés et/ou inhibés par la mycorhization (expression spatio-temporelle, réponse aux éliciteurs, analyse fonctionnelle par transgenèse) et la comparaison des profils protéiques et des transcrits fongiques lors des étapes présymbiotique (spores germées ou non) et symbiotique (racine mycorhizée, mycélium extraradiculaire), nous permettront une vision compréhensive de leur rôle au sein de la symbiose.
L'ensemble de ces informations génétiques et moléculaires devraient nous conduire à définir le programme cellulaire de la symbiose MA et en particulier à identifier des marqueurs moléculaires de son fonctionnement. Enfin, la caractérisation des gènes symbiotiques clefs ouvrira la voie à l'obtention de plantes surexprimant leur caractère symbiotique et dont l'exploitation en agriculture favorisera une réduction d'intrants chimiques.
ATS INRA 2000-2003, Réseau Protéome Vert, Projet UE Medicago 2000-2003. (http://medicago.toulouse.inra.fr/EU/mtindex.htm)
Collaborations : Drs. P. Gamas et E-P. Journet, INRA/CNRS, Toulouse ; Dr. M. Dieu et M. Raes, FUNDP-URBC, Namur, B ; Dr. P. Franken, MPI, Marbourg, D.

2-2 Recherches sur la structure et l'organisation du génome des Gloméromycètes
L'utilisation efficace des MA en production végétale nécessite une connaissance approfondie de la biologie des champignons impliqués. Selon nos données précedentes, ces champignons possèdent un génome complexe et de grande taille (108-109bp), où les noyaux d'un même isolat ne seraient pas génétiquement identiques. Nos recherches sont réalisées en concertation avec les principaux groupes européens travaillant sur les Gloméromycères, l'ambition étant de faire émerger un réseau d'excellence sur ces champignons et leur rôle dans la santé des plantes et la qualité des produits.
Nous continuerons nos recherches sur la complexité du génome des Gloméromycètes par : (i) la caractérisation et la localisation nucléaire des séquences répétées (sites de transposons supposés jouer un rôle dans l'évolution chez d'autres organismes), (ii) la localisation nucléaire des loci de gènes ayant une fonction clé (nutrition phosphatée/ azotée, tolérance aux métaux lourds), (iii) la mise en évidence et la localisation nucléaire des télomères (les chromosomes n'ont pas été mis en évidence chez les Gloméromycètes, (iv) La participation au projet de séquençage de Glomus intraradices du Joint Genome Institute (USA).
Projet UE Genomyca 2001-2004 (http://www.dijon.inra.fr/bbceipm/genomyca/)
Collaborations : Dr. L. Harrier, SAC, Edinburgh, UK; Dr. M. St Arnaud, IRBV, Montréal, C.; C. Chapiro, JGI, Walnut Creek, USA; F. Lammers, New Mexico State University, Las Cruces, USA.

2-3 Exploitation biotechnologique des mycorhizes en production végétale
L'objectif de nos recherches cognitives sur les MA est l'utilisation de techniques d'ingénierie écologique telles que la mycorhization contrôlée et plus largement la biotisation des plantes par divers microorganismes bénéfiques au développement d'une agriculture 'alternative' moins polluante pour l'environnement et dont les produits sont exempts de résidus chimiques. Nous travaillerons à la mise en place d'un label de qualité d'une collection fongique de ressources génétiques, à vocation internationale, The International Bank for Glomeromycota (IBG) (http://www.ukc.ac.uk/bio/beg/) afin de mieux exploiter ces champignons en agronomie.
L'utilisation efficace des Gloméramycètes dépend aussi du pouvoir compétitif de l'inoculum introduit vis-à-vis des champignons indigènes. Nous utiliserons une nouvelle technologie pour suivre le devenir d'un inoculum introduit dans les conditions agricoles, basée sur la PCR quantititative en gigogne, qui permet d'identifier des espèces fongiques dans le sol ou dans les racines de différentes plantes cultivées au champ. Pour cela, le niveau resolutif de notre collection de sondes taxon-discriminantes (de la famille à l'espèce) sera étendue pour couvrir aussi des isolats dans le phylum des Gloméramycètes. Une des retombées envisagées sera la création d'un ensemble de méthodes cohérentes et simples, rassemblées sous la forme d'un kit pouvant être utilisé de manière rapide et fiable pour identifier et quantifier les champignons MA dans un échantillon donné de racine ou de sol.
Nos études précédentes de biotisation ont montré que, sous certaines conditions, des micro-organismes (Gloméromycètes, Trichoderma, Gliocladium) ayant des effets bénéfiques complémentaires sur la croissance et la santé des plantes peuvent être co-introduits avec succès dans le cycle de production des vitroplants. Ces recherches se poursuivront en visant: (i) la compréhension des mécanismes de bioprotection résultant de la synergie entre micro-organismes bénéfiques, par l'isolement des molécules actives impliquées (biopesticides) et l'identification de leur(s) cible(s) d'action, (ii) l'étendue à plusieurs espèces végétales des techniques de biotisation et l'application à grande échelle de cette biotechnologie. Projet UE Mychintec 2000-2003 (http://www.dijon.inra.fr/bbceipm/Mychintec/)
Collaborations : Dr M-C. Lemoine, UME 1011 INRA/Agri Obtentions, Dijon.
Titre : De la biotisation des plantes au développement de pesticides naturels

Rappel du contexte :
La nécessité de réduire les intrants chimiques (engrais, pesticides) en agriculture tout en maintenant un niveau élevé de production passe obligatoirement par l'utilisation raisonnée d'un ou plusieurs microorganismes bénéfiques. Cette biotechnologie appelée « Biotisation » (Gianinazzi et al. 2003) repose sur la recherche de microorganismes compatibles dans leur développement respectif, la mise au point de méthodologies d'inoculation et la définition des conditions environnementales favorables au développement harmonieux des plantes biotisées. Les plantes micropropagées se prêtent particulièrement bien au développement de cette biotechnologie, du fait de l'absence totale de microbes dans leurs tissus lors de la sortie de l'in vitro.

Résultats originaux obtenus :
Les équipes de PME et de l'UME UP Vitro (Agri Obtentions) ont été des pionniers dans ce domaine. Des résultats très prometteurs ont été obtenus en serre et en champ notamment chez la tomate, le framboisier et l'artichaut (augmentation du rendement, réduction de l'index pathologique). Nos travaux ont démontré la faisabilité de cette biotechnologie dans des expériences en vraie grandeur, notamment grâce à l'aide d'un projet européen CRAFT. Toutefois il existe des limites liées à nos faibles connaissances des mécanismes d'interaction entre microorganismes bénéfiques et entre ceux-ci et la plante-hôte, notamment au niveau de la rhizosphère. Le rôle structurant des mycorhizes tant sur la morphophysiologie des racines que sur le succès de l'inoculation avec d'autres microbes bénéfiques a été révélé, notamment chez le framboisier et l'artichaut. Des travaux en cours démontrent qu'une bactérie isolée de la mycorhizosphère (Paenibacillus) produit un facteur antagoniste responsable de la mort de plusieurs champignons pathogènes du sol, mais stimulant la mycorhization et en définitive le développement et la santé des plantes.

Conséquences, perspectives :
Les résultats obtenus ouvrent d'importantes perspectives tant au niveau cognitif (expliquer pourquoi deux ou plusieurs microorganismes bénéfiques peuvent, dans certaines conditions, coopérer entre eux pour le bien être de la plante-hôte et dans d'autres avoir des effets négatifs sur le développement du végétal) que du transfert de technologie. En effet les connaissances acquises par ces travaux peuvent être facilement transférées à d'autres plantes cultivées. L'isolement des molécules antagonistes ou stimulantes, selon qu'il s'agisse d'un microorganisme pathogène ou symbiotique ouvre, la voie au développement d'une nouvelle catégorie de biopesticides.


Collaborations : UME UP Vitro/Agri Obtentions, Dijon.

Publications majeures :
- Budi SW, van Tuinen D, Martinotti G, Gianinazzi S 1999. Isolation from the Sorghum bicolour mycorrhizosphere of a bacterium compatible with arbuscular mycorrhiza development and antagonistic towards soilborne fungal pathogens. Applied and Environmental Microbiology 65, 5148-5150.
- Cordier C, Lemoine MC, Lemanceau P, Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S 2000. The beneficial rhizosphere : a necessary strategy for microplant production. In : Proceedings of the International Symposium on Methods and Markers for Quality Assurance in Micropropagation. Cassells AC, Doyle BM, Curry RF (eds). ISHS, Acta Horticulturae, Belgium, vol. 530, 259-268.
- Gianinazzi S, Oubaha L, Chahbandar M, Blal B, Lemoine MC, 2003. Biotization of microplants for improved performance. In: "Proceedings of the XXVI International Horticultural Congress: Biotechnology in Horticultural crop Improvement: achievement, opportunities and limitations", Hammerschlag F.A., Saxena P. (eds). ISHS, Acta Horticulturae, Belgium,625,165-172.
- Gianinazzi S, Vosatka M, 2004. Inoculum of arbuscular mycorrhizal fungi for production systems: science meets business. Canadian Journal of Botany, 82, 1264-1271.

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Titre : Mise au point d'un texte d'écotoxicité terrestre à l'aide de champignons mycorhizogènes

Rappel du contexte :
Le recyclage des déchets en agriculture est soumis à une réglementation principalement basée sur des critères physico-chimiques de qualité, or cette approche ne permet pas de déterminer la toxicité potentielle vis-à-vis des organismes du sol. Le développement et la validation de l'utilisation de tests d'écotoxicité permettrait une meilleure gestion des déchets en agriculture. Les champignons mycorhizogènes à arbuscules sont des microorganismes ubiquistes associés à plus de 80 % des espèces végétales qui interviennent dans la nutrition minérale et la résistance aux stress biotique et abiotique des plantes. Ces champignons sont des organismes-clés dans les systèmes sol-plante, qu'il apparaît important de prendre en compte dans une évaluation de la toxicité des déchets vis-à-vis des écosystèmes.

Résultats originaux obtenus :
Des travaux antérieurs ont montré que le champignon mycorhizogène G. mosseae répond à la présence de déchets et de polluants (Jacquot et al. 2000). Des tests d'écotoxicité basés sur le suivi de la germination des spores et la colonisation des racines d'une plante-hôte par Glomus mosseae ont été développés. Actuellement les premiers résultats des essais interlaboratoires, nécessaires à la validation et à la normalisation d'un test d'écotoxicité, ont montré que la germination des spores de G. mosseae est affectée par la présence de deux substances tests (le nitrate de cadmium et le benlate). Un premier essai sur la colonisation racinaire de Medicago truncatula (lignée J5) en présence de cadmium montre un effet similaire à celui observé sur la germination des spores.

Conséquences, perspectives :
Pour le test de germination des spores, les essais interlaboratoires montrent des courbes d'inhibition de germination des spores similaires. Les essais interlaboratoires pour le test de colonisation n'ont pas encore démarré. Au final, les données obtenues pour ces tests seront examinées par une commission d'experts désignés par l'AFNOR en vue de leur potentielle normalisation. Par la suite ces tests de toxicité pourront être sélectionnés par une commission d'experts, désignés par l'ADEME, pour être inclus dans une batterie de tests pertinents, adaptés à la valorisation agricole des déchets, à l'impact des déchets sur les écosystèmes ou encore à la caractérisation des sites ou sols pollués.

Collaborations : LIMOS/ CNRS, Nancy.

Publications majeures :
- Jacquot E., van Tuinen D., Gianinazzi S. et Gianinazzi-Pearson V. Monitoring species of arbuscular mycorrhizal fungi in planta and in soil by nested PCR : application to the study of the impact of sewage sludge. Plant Soil 226, 179-188. (2000).
- in press - Gianinazzi S., Plumey-Jacquot E., Gianinazzi-Pearson V., Leyval C., 2005. Contribution of arbuscular mycorrhiza to soil quality and terrestrial ecotoxicology. In: Microbiological Methodes for Assessing Soil Quality Bloem J., Hopkins D.W., Benedetti A. (eds). CABI International, Wallingford, UK.

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Titre : Sondes spécifiques des champignons mycorhizogènes (Gloméromycètes)

Rappel du contexte :
Les Gloméromycètes sont des symbiotes obligatoires et leur capacité à coloniser les racines ainsi que leur activité symbiotique sont sensibles aux pratiques culturales utilisant des pesticides et de forts apports d'engrais et peuvent être également affectées par les métaux lourds et les polluants organiques. De plus, aucune méthode n'existait pour différencier les différentes espèces de Gloméromycètes vivant en symbiose avec les racines. L'obtention de sondes moléculaires est donc une préalable à toute gestion raisonnée de ces microsymbiotes en production végétale.

Résultats originaux obtenus :
De telles sondes ont été développées dans notre laboratoire à partir des gènes codant pour les ARN ribosomiques (ADNr). L'alignement de séquences de Gloméramycètes dans la région de la grande sous-unité de l'ADNr obtenues à partir d'ADN extrait de spores a permis de dessiner des amorces oligonucléotidiques ayant différents niveaux de spécificité depuis l'ordre jusqu'à l'espèce. Ainsi, un protocole de PCR en gigogne a pu être mis au point pour la première fois dans notre laboratoire pour la détection et l'identification des Gloméromycètes dans les racines et les sols. L'ADN extrait de racines ou de mycelium dans le sol sert de matrice pour l'amplification de l'ADNr en utilisant des amorces universelles pour les eucaryotes. Les produits de PCR générés sont ensuite utilisés dans une seconde PCR en utilisant des amorces spécifiques au niveau de l'espèce. Il a ainsi été possible de suivre la diversité des Gloméromycètes inoculés en mélange à différentes plantes dans des microcosmes (van Tuinen et al. 1998). Cette approche a été ensuite étendue à l'étude de la diversité des Gloméromycètes dans des sols de prairie (Gollotte et al., 2003) et dans des sols amendés en boues d'épuration ou contaminés par des métaux lourds (Jacquot et al. 2000 ; Jacquot-Plumey et al. 2001; Turnau et al. 2001). Finalement, dans le cadre d'un projet européen en association avec la Chine (MYCHINTEC), cet outil moléculaire est maintenant utilisé pour suivre la persistance d'inoculum apporté lors de la production au champ de patate douce, de manioc et de maïs.

Conséquences, perspectives :
Ces résultats peuvent déboucher sur la création d'un kit de détection qui devrait trouver plusieurs applications : (i) certification d'inocula par le producteur, notamment par la « Federation of European Mycorrhiza Fungi Inoculum Producer » qui vient de se créer, (ii) suivi des inocula au champ, (iii) diagnostic sur la diversité et l'abondance de champignons mycorhizogènes dans divers situations agricoles ou des milieux naturels.

Collaborations : Scottish Agricultural College, Edinburgh ; Jagellonian University, Cracovie.

Publications majeures :
- Gollotte A, van Tuinen D, Atkinson D (2004) Ecological specificity in the arbuscular mycorrhizal symbiosis established by the grass species Agrostis capillaris and Lolium perenne. Mycorrhiza 14 (2), 111-117.
- Jacquot E, van Tuinen D, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2000) Monitoring species of arbuscular mycorrhizal fungi in planta and in soil by nested PCR: application to the study of the impact of sewage sludge. Plant and Soil 226:179-188.
Jacquot-Plumey E, van Tuinen D, Chatagnier O, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2001) 25S rDNA-based molecular monitoring of glomalean fungi in sewage sludge-treated field plots. Environ Microbiol 3:525-531.
Turnau K, Ryszka P, Gianinazzi-Pearson V, van Tuinen D (2001) Identification of arbuscular mycorrhizal fungi in soils and roots of plants colonizing zinc wastes in southern Poland. Mycorrhiza 10:169-174.
van Tuinen D, Jacquot E, Zhao B, Gollotte A, Gianinazzi-Pearson V (1998) Characterization of root colonization profiles by a microcosm community of arbuscular mycorrhizal fungi using 25S rDNA-targeted nested PCR. Mol Ecol 7:879-887.

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Titre : Protéomique des interactions plantes -microorganismes bénéfiques du sol

Rappel du contexte :
Suite à l'augmentation exponentielle des données génomiques et aux séquençages complets de plusieurs organismes des techniques analytiques dites "à grande échelle", telles que les analyses de transcriptome et de protéome, ont vu le jour afin d'étudier de façon massive et sans à priori les génomes fonctionnels. La notion récente de protéome fait référence à la totalité des protéines exprimées par le génome d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme à un moment donné et dans un état physiologique donné. Par analogie avec la transcriptomique qui permet un recensement des gènes transcrits, la protéomique consiste donc en une analyse systématique des protéines. Cette approche complémentaire renseigne sur les niveaux de traduction des protéines qui ne sont pas toujours corrélés aux niveaux de transcription. De plus elle permet d'accéder à des informations supplémentaires comme les modifications post-traductionnelles. La compréhension des processus symbiotiques majeurs tels que les symbioses mycorhiziennes et rhizobiennes passe par la connaissance des gènes et des protéines reliés à de tels mécanismes. Parallèlement aux analyses du transcriptome de la symbiose mycorhizienne à arbuscules entrepris au sein de notre UMR (projet EU QLG2-CT-2000-00676 et ATS INRA), nous nous sommes engagés dans l'étude du protéome symbiotique (Dumas-Gaudot et al., 2001).

Résultats originaux obtenus :
Pour la première fois, nous avons démontré la faisabilité et l'intérêt de l'approche protéomique pour l'étude des symbioses racinaires. Ainsi, dans les racines de Medicago. truncatula nous avons pu visualiser 76 et 73 protéines nouvellement induites en réponse, respectivement, aux symbioses mycorhizienne et rhizobienne. Dans le 1er cas, 14 protéines ont déjà été identifiées et se répartissent dans les catégories des protéines de défense, de la physiologie des racines, de la respiration mais aussi des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire ou dans la régulation génique. Dans le 2ème cas, 16 protéines ont été identifiées : elles se répartissent parmi les protéines du métabolisme azoté et carboné, du métabolisme des acides aminés et également, ainsi que pour la symbiose mycorhizienne, des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire ou dans la régulation génique (1, 2). Deux nouvelles protéines, n'ayant pas d'homologie dans les bases de données ont été révélées dans le cas des mycorhizes. Enfin, nous avons établi que l'approche protéomique peut être aussi utilisée d'une façon plus ciblée afin, par exemple, de révéler l'impact de xénobiotiques sur les symbioses et/ou sur les microorganismes isolés. Des protéines induites par le cadium, mais dont le niveau d'expression est modulé par la symbiose mycorhizienne ont ainsi été identifiées (3).

Conséquences, perspectives :
L'utilisation de l'approche protéomique s'est révélée particulièrement puissante et performante pour étudier les symbioses mycorhiziennes à arbuscules pour lesquelles, le système biologique, de part sa complexité, avait jusqu'à présent fortement restreint les possibilités d'identification des protéines impliquées dans ce type d'interaction plantes/champignons. La conduite parallèle, au sein de notre groupe, des études du transcriptome et du protéome lors des stades précoces et tardifs, conjointement à l'utilisation de plantes mutantes devront très prochainement nous permettre d'identifier des modifications post-traductionnelles des protéines, dont les rôles peuvent être déterminant dans la compréhension et la maîtrise de ce processus symbiotique.

Collaborations : 1) Dr M. Dieu, Université de Namur, Belgique ; 2) Réseau protéome vert INRA ; 3) Dr. M. St-Arnaud, Université de Montréal, Québec, Canada.

Publications majeures :
- Dumas-Gaudot E, Bestel-Corre G, Gianinazzi S (2001) Proteomics, a powerful approach towards understanding functional plant root interactions with arbuscular mycorrhizal fungi. In: "Recent developments in plant biology", Pandalai S. (ed). Research Signpost, Trivandrum, India, 95-104.
- Bestel-Corre G, Dumas-Gaudot E, Poinsot V, Dieu M, Dierick JF, van Tuinen D, Remacle J, Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S (2002) Proteome analysis and identification of symbiosis-related proteins from Medicago truncatula Gaertn. by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Electrophoresis 23: 122-137.
- Repetto O, Bestel-Corre G. Berta G. Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S (2003) Targeted proteomics to identify cadmium-induced protein modification in Glomus mosseae-inoculated pea roots. New Phythologist 157: 555.567.
- Dumas-Gaudot E, Amiour N, Weidmann S, Bestel-Corre G, Valot B, Lenogue S, Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S, (2004) A technical trick for studying proteomics in parallel to transcriptomics in symbiotic root-fungus interactions. Proteomics, 4: 451-453.
- Dumas-Gaudot E, Valot B, Bestel-Corre G, Recorbet G, St-Arnaud M, Fontaine B, Dieu M, Raes M, Saravanan RS, Gianinazzi S (2004) Proteomics as a way to identify extra-radicular fungal proteins from Glomus intraradices - RiT-DNA carrot root mycorrhizas. FEMS Microbiology Ecology, 48: 401-411.
- Valot B, Gianinazzi S, Dumas-Gaudot E (2004) Sub-cellular proteomic analysis of a Medicago truncatula root microsomal fraction. Phytochemistry, 65: 1721-1732.

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Titre : Génomique fonctionnelle des symbioses mycorhiziennes

Rappel du contexte :
Par son rôle dans l'acquisition d'éléments minéraux du sol et la santé des plantes, la mycorhize à arbuscules occupe une position stratégique dans le devéloppement et la survie de nombreuses espèces végétales dans les écosystèmes naturels et cultivés. Décrypter le dialogue moléculaire de l'état mycorhizien et ensuite l'exploiter dans le développement d'une production végétale durable intégrant l'utilisation de microorganismes bénéfiques est d'une importance primordiale en agronomie. Cela passe par l'identification de gènes clés de la mycorhize à arbuscules, la détermination de leur régulation au niveau cellulaire et leur utilisation en vue d'optimiser l'efficacité symbiotique.

Résultats originaux obtenus :
Les analyses du transcriptome symbiotique réalisées ces dernières années nous ont fourni une quantité importante d'informations concernant les gènes régulés lors des interactions racine/champignon mycorhizogène. Par des approches ciblant les gènes végétaux candidats d'un rôle dans la mycorhize fonctionnelle, et utilisant diverses techniques (RT-PCR, qPCR, stratégie gène rapporteur), nous avons mis en évidence l'activation d'une quinzaine de gènes impliqués principalement dans les fonctions membranaires, l'atténuation de stress abiotique, le métabolisme pariétal ou les réponses de défense. Fait marquant, nous venons de démontrer, pour la première fois, que deux gènes codant des H+ATPases plasmalemmiques sont spécifiquement activées au niveau des cellules impliquées dans les échanges entre les 2 partenaires symbiotiques. Une recherche plus globale chez le pois et Medicago truncatula, basée sur les approches non ciblées (DDRT-PCR, SSH, séquençage d'ESTs à grande échelle/analyses in silico), nous a permis d'identifier un grand nombre de gènes activés (260), lors des premiers contacts champignon/racine (étape appressoria) et/ou à l'étape arbusculaire, dont la plupart sont rapportés pour la première fois chez les associations mycorhiziennes. Fait marquant, environ 25% de ces gènes sont décrits pour la première fois. Ceux de M. truncatula (>2500 ESTs) font partie de micro-réseaux générés dans le cadre d'un projet européen (QLG2-CT-2000-00676), dont l'exploitation est en cours par différents groupes européens, y inclus le nôtre. A noter que certains des gènes activés lors de la mycorhization le sont aussi dans le cas de la nodulation (30) et des interactions racinaires avec un Pseudomonas bénéfique (6), confortant ainsi notre hypothèse d'événements moléculaires communs aux symbioses racinaires.

Conséquences, perspectives :
Les connaissances acquises par les analyses transcriptomiques permettront d'identifier des marqueurs moléculaires du trait symbiotique chez les plantes mycorhizées. L'identification des gènes correspondants ouvrira la voie à la création de plantes améliorées dans leurs capacités symbiotiques. Enfin, la combination des approches transcriptomiques, protéomiques et biochimiques permettra de découvrir les voies clés qui régulent et/ou déterminent la mise en place et le fonctionnement des interactions racine/champignon symbiotique.

Collaborations : INRA/CNRS Toulouse, MPI Marburg, Université de Bielefeld.

Publications majeures :
- Gianinazzi-Pearson V, Arnould C, Oufattole M, Arango M, Gianinazzi S (2000) Differential activation of H+-ATPase genes by an arbuscular mycorrhizal fungus in root cells of transgenic tobacco. Planta 211, 609-613.
- Roussel H, van Tuinen D, Franken P, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2001) Signalling between arbuscular mycorrhizal fungi and plants : identification of a gene expressed during early interactions by differential RNA display analysis. Plant and Soil 232, 13-19.
- Journet EP, El-Ghachtouli N, Vernoud V, de Billy F, Pichon M, Dedieu A, Arnould C, Morandi D, Barker DG, Gianinazzi-Pearson V (2001) Medicago truncatula ENOD11 : a novel RPRP-encoding early nodulin gene expressed during mycorrhization in arbuscule-containing cells. Molecular Plant-Microbe Interactions 14, 737-748.
- Journet EP, van Tuinen D, Gouzy J, Crespeau H, Carreau V, Farmer MJ, Niebel A, Schiex T, Jaillon O, Chatagnier O, Godiard L, Micheli F, Kahn D, Gianinazzi-Pearson V, Gamas P (2002) Exploring root symbiotic programs in the model legume Medicago truncatula using EST analysis. Nucleic Acids Research 30, 5579-5592.
- Sanchez L, Weidmann S, Brechenmacher L, Batoux M, van Tuinen D, Lemanceau P, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2004) Common gene expression in Medicago truncatula roots in response to Pseudomonas fluorescens colonization, mycorrhiza development and nodulation. New Phytologist 161, 855-863.
- Brechenmacher L, Weidmann S, van Tuinen D, Chatagnier O, Gianinazzi S, Franken P, Gianinazzi-Pearson V (2004) Expression profiling of up-regulated plant and fungal genes in early and late stages of Medicago truncatula-Glomus mosseae interactions. Mycorrhiza 14, 253-262.
- Weidmann S, Sanchez L, Descombin J, Chatagnier O, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2004) Fungal elicitation of signal transduction-related plant genes precedes mycorrhiza establishment and requires the dmi3 gene in Medicago truncatula. Molecular Plant-Microbe Interactions 17, 1385-1393.
- in press- Sanchez L, Weidmann S, Arnould C, Bernard AR, Gianinazzi S, Gianinazzi-Pearson V (2005) P. fluorescens and G. mosseae trigger DMI3-dependent activation of genes related to a signal transduction pathway in roots of Medicago truncatula. Plant Physiology. La presque totalité des plantes cultivées et de nombreuses essences forestières ne forment pas des racines sensu stricto, mais des mycorhizes à arbuscules (MA) ainsi appelées à cause des structures fongiques (arbuscules) que les champignons symbiotiques (Gloméramycètes) forment à l'intérieur des cellules de la racine, et qui sont le site d'échanges nutritionnels entre les deux symbiotes. Parallèlement à ce développement endocellulaire, les champignons développent un vaste réseau d'hyphes dans le sol et, par conséquent, constituent une interface de première importance entre le sol et la plante en intervenant dans plusieurs processus clefs de la vie des plantes (développement, nutrition minérale, protection vis-à-vis des stress abiotiques et biotiques) et de l'écosystème (flux d'éléments et conservation de la structure des sols). Cependant, les pratiques culturales peuvent affaiblir et/ou altérer les populations de champignons mycorhizogènes. Or, l'évolution vers une agriculture durable passe obligatoirement par une utilisation de ces symbiotes de racines, seuls ou en association avec d'autres micro-organismes telluriques bénéfiques. Un tel objectif implique d'une part de savoir maîtriser le développement et le fonctionnement des champignons mycorhizogènes, et d'autre part de connaître les programmes génétiques et cellulaires qui régissent les symbioses qu'ils forment.
Ainsi, nos recherches ont pour objectifs : (i) de définir les programmes cellulaires des interactions plante-champignons MA pour mieux comprendre les mécanismes en jeu et dessiner les marqueurs moléculaires du fonctionnement, (ii) de comprendre la structure et l'organisation des Gloméramycètes, et (iii) d'exploiter les processus biologiques impliqués pour favoriser la mise en place de systèmes de production végétale plus respectueux de l'environnement.
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